Molekularbiologie

Labor für Molekulargenetische Diagnostik

Unsere Fachbereiche

Genetische Analysen sind in der modernen Medizin ein wesentlicher Bestandteil der Diagnostik.

Im LMGD werden Fragestellungen aus der Hämatologie, Onkologie und Humangenetik bearbeitet. Die Übergänge sind dabei oft fließend – viele Tumore haben einen erblichen Hintergrund. Aber nicht nur Veränderungen in der Erbsubstanz werden untersucht, auch die Bestimmung des Anteils von Spender- und Empfängerzellen nach Stammzell-Transplantationen mit genetischen Markern (Chimärismus-Analyse) ist eine wichtige Aufgabe des LMGD.

Fachlich-methodisch besteht das LMGD aus zwei großen Teilbereichen, der Molekulargenetik sowie der Tumorzytogenetik. Die Molekulargenetik analysiert Veränderungen auf Gen-Niveau und arbeitet mit isolierter Erbsubstanz (DNA bzw. RNA). Die Tumorzytogenetik arbeitet klassischerweise an Zellen (DNA in Zellkernen, Chromosomen), aber auch hier sind die Übergänge fließend.

Molekulargenetik

Aus verschiedenen Patientenproben (peripheres Blut, Knochenmark, Körperzellen, Gewebe) wird in diesem Laborbereich automatisiert DNA oder RNA gewonnen. Diese Nukleinsäuren dienen als Ausgangsmaterial für alle weiteren molekularen Analysen.

Sie können jahrelang bei -20°C oder -70°C gelagert werden, um bei künftigen neuen Entwicklungen in der Medizin für PatientInnen wichtige Tests gegebenenfalls am Archivmaterial zu erlauben.

Die PCR ist der Ausgangspunkt für die meisten molekularbiologischen Analysen, da sie Abschnitte der DNA milliardenfach vermehren kann und damit in den „sichtbaren“ Bereich bringt. Durch die hohe Empfindlichkeit (1 Tumorzelle kann in 1 Million normalen Zellen nachgewiesen werden!) müssen die Arbeitsbereiche vor und nach der PCR streng getrennt werden. Mittels PCR und anschließender Elektrophorese können Genveränderungen bei Tumoren oder in der Humangenetik direkt nachgewiesen werden.

Real Time PCR ist eine Sonderform der PCR, bei der mittels Fluoreszenz-Sonden eine genaue Messung der in der PCR gebildeten Produkte erfolgt.

Damit ist sie ein ideales Mittel, um hochempfindlich das Ansprechen eines Patienten auf verschiedene Tumortherapien zu testen. Auch Mutationsnachweise sind damit möglich.

Mittels Elektrophorese werden PCR-Produkte im elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt und sichtbar gemacht. Sie dient auch der Überprüfung von PCR-Produkten, die als Zwischenstufe (z.B. für eine Sequenzierung) verwendet werden.

Die „denaturierende Flüssigkeits-Chromatographie“ (DHPLC) wird zur Überprüfung von PCR-Produkten eingesetzt und kann teilweise die Elektrophorese ersetzen.
Mit ihr lassen sich aber auch einfach und kostengünstig Mutationen suchen; sie ist daher eine ideale Ergänzung zur Sequenzierung.

Next-Generation Sequencing (NGS) ermöglicht die simultane Sequenzierung von vielen Targets (Genen) bis zu einem gesamten Exom oder Genom. Damit können sehr effizient Fragestellungen bearbeitet werden, bei denen Mutationen in verschiedenen Genen auftreten können.

Die Sequenzierung erlaubt die genaueste Untersuchung von DNA Nukleotid für Nukleotid, daher Buchstabe für Buchstabe. Sie wird zum Nachweis von kleinsten (Punkt-) Mutationen verwendet. Mit dem Sequencer können jedoch auch Fluoreszenz-markierte PCR-Produkte oder andere DNA aufgetrennt werden. Beim Next Generation Sequencing (NGS) ist es durch neueste Technologien möglich, viele Sequenzreaktionen parallel ablaufen zu lassen. Daher können entweder bei einer Probe sehr viele Gene auf einmal, oder ausgewählte Gene (Panels) bei mehreren Proben parallel sequenziert werden.

Zytogenetik

Kultivierte Zellen werden im Labor häufig benötigt. Kurzzeitkulturen von Patientenmaterialien (Knochenmark, peripheres Blut) sind beispielsweise der Startpunkt der meisten zytogenetischen Untersuchungen.

Referenzzelllinien dienen als Kontrollen und für Sensitivitätstests in der Molekularbiologie. Solche Zelllinien können in flüssigem Stickstoff jahrelang gelagert und bei Bedarf wieder aufgetaut und „reaktiviert“ werden.

In der konventionellen Zytogenetik kann das gesamte Genom, wenn auch nur auf größere Veränderungen hin, untersucht werden. Dazu werden Zellen kultiviert, aus denen Chromosomen präpariert und gefärbt werden. Die gefärbten Chromosomen werden automatisch auf Objektträgern gesucht und nach einer Beurteilung aufgenommen.

Mittels Computerprogrammen werden durch erfahrene MitarbeiterInnen die Chromosomen sortiert und auf mikroskopisch sichtbare genetische Veränderungen hin untersucht. Im LMGD werden nur Tumore zytogenetisch analysiert.

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) untersucht mittels Gensonden genetische Veränderungen an Chromosomen oder Zellkernen. Mittels solchen Sonden können einzelne Gene, Chromosomenabschnitte, ganze Chromosomen oder sogar alle Chromosomen auf einmal (jedes in einer eigenen Farbe) analysiert werden.

 FISH wird oft ergänzend zur konventionellen Zytogenetik durchgeführt, um unklare Situationen aufzuklären. Auch an fixierten Geweben, z.B. von Tumoren, kann FISH angewendet werden.

SNP Array ist die molekulare hochauflösende Fortführung der Zytogenetik. Auf dem Microarray sind Millionen von Gensonden gebunden, mit denen Verluste oder Zugewinne von Genmaterial an Patientenproben festgestellt werden können. SNP Array wird meist eingesetzt, wenn ein dringender Verdacht auf eine genetische Veränderung vorliegt, die konventionelle Zytogenetik jedoch unauffällig war. Speziell in der Humangenetik spielt sie eine bedeutende Rolle.